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Notícias




09/03/2015
SPECIALIZED INSULIN IS USED FOR CHEMICAL WARFARE BY FISH-HUNTING CONE SNAILS

​Comentário sobre o artigo feito pelos Drs. Álvaro Prieto e André Zaharenko do Laboratório de Genética do Instituto Butantan

 

Safavi-Hemami H et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2015, 112(6):1743-8.

Os caramujos marinhos peçonhentos do gênero Conus são realmente animais predadores surpreendentes, em especial, devido à grande variedade e à beleza intrínseca de suas conchas. Há muito, estes caramujos predadores atraem a atenção de colecionadores, pescadores, mergulhadores e aquaristas. Interesse que é sempre acompanhado por certa dose de perigo evidente, já que existem pelo menos cerca de 30 acidentes envolvendo seres humanos neste grupo de interesse, com óbitos bem documentados.

Desde que o mundialmente famoso, Professor Baldomero Olivera, ainda em 1970 nas Filipinas, começou a estudar esses envenenamentos, estes animais fascinam também os zoólogos, toxinologistas e farmacologistas. Em princípio, pela potência de suas peçonhas, o que os inclui entre os organismos mais venenosos do mundo, mas também por apresentarem inúmeras estratégias de ocupação de nichos ecológicos nas águas tropicais. Consequentemente, seu comportamento predatório também causa surpresa, por sua criativa diversidade evolutiva. É realmente surpreendente ver um Conus piscívoro caçar um peixe paralisando-o instantaneamente após lancetá-lo com seu arpão ligado à sua glândula de veneno. Suas preferências alimentares também são diversificadas, havendo espécies especializadas em predar outros moluscos, enquanto que algumas se especializam em alimentar-se de vermes poliquetos. Mesmo entre aqueles que predam peixes, as estratégias de caça são variadas: algumas espécies fisgam os peixes como descrevemos (estratégia semelhante ao uso de uma vara com anzol), enquanto que outros literalmente pescam um cardume de peixes estendendo uma “rede” ou saco formado por sua enorme probóscide, para depois arpoar, um por um, cada peixinho capturado.

São conhecidas cerca de 500 espécies destes caramujos marinhos predadores, cada espécie contendo um conjunto próprio e diferente de inúmeras toxinas peptídicas paralisantes, denominadas conotoxinas. De tal forma, que a quantidade e diversidade de conotoxinas são ainda mal conhecidas nas suas potencialidades, ainda que sejam intensamente estudadas por toxinologistas e neurofisiologistas de diversos laboratórios. O número de espécies associado ao grande número de toxinas produzidas em cada grupo multiplica exponencialmente o leque do arsenal de moléculas peptídicas capazes de afetar inúmeros receptores e transportadores de neurotransmissores, canais iônicos e alvos celulares efetores,

 

tal como receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Os receptores afetados incluem os nicotínicos, adrenérgicos, receptor de glutamato tipo NMDA, e os serotoninérgicos, por exemplo. Entre os canais iônicos bloqueados ou modulados, podemos citar os de sódio, potássio e cálcio, em sua maioria. O efeito mais letal das conotoxinas para os seres humanos é a paralisia do músculo do diafragma causando parada respiratória. Desta forma, a implicação das conotoxinas como ferramentas de pesquisa ou a serem exploradas como medicamentos, fica evidente. Consequentemente, por ser uma das primeiras drogas desenvolvidas a partir do estudo destas peçonhas de Conus, não podemos deixar de citar o analgésico ziconotida (Prialt®), uma droga que é 1000 vezes mais potente do que a morfina e foi concebida com base em uma w-conotoxina (bloqueadora de canais de Ca2+ dependentes de voltagem) produzida pelo caramujo Conus magus.  O potencial inovador das conotoxinas mostra que quando se trata de Conus, a literatura é rica em novas toxinas, novas ações e novas potencialidades.

Mas mais uma vez, este grupo de animais e suas toxinas nos surpreendem: Helena Safavi, trabalhando no grupo do professor Olivera na Universidade de Utah, EUA, descreve no artigo publicado recentemente no PNAS em 10 de Fevereiro de 2015, que, pelo menos duas espécies, Conus geographus- uma das espécies mais estudadas deste gênero - e C. tulipa, transformaram insulina em uma arma subaquática.

Estes caramujos são piscívoros e emboscam grupos de peixes à noite nos recifes de coral utilizando sua longa probóscide para enredar o cardume. Estes moluscos são relativamente lentos se comparados aos peixes e precisam se aproximar furtivamente do cardume. O Professor Baldomero Olivera já havia descrito, que de início quando se aproxima e estende sua probóscide, C. geographus secreta na água do mar um coquetel de toxinas que atordoam os peixes, o que ele denomina de “cabala nirvânica” (conopeptídeos que preferencialmente atuam sobre GPCRs e recaptadores de neurotransmissores) entorpecendo e aquietando o grupo de peixes que está sendo capturado quase sem perceber. Em seguida, após entorpecerem os peixes, cada um deles é capturado após terem sido injetados com um coquetel de toxinas que Olivera chama de “cabala motora” (preferencialmente conotoxinas que bloqueiam ou modulam canais iônicos e receptores nicotínicos) cujos componentes neurotóxicos provocam o choque eletrofisiológico e brutal comprometimento da neurotransmissão, promovendo paralisia instantânea nas presas.

O estudo de Helena Safavi e colegas sugere uma inusitada forma do C. geographus atordoar suas presas antes de capturá-las: quando estes furtivos predadores emboscam suas presas, eles liberam insulina na coluna de àgua. A insulina penetra pelas guelras dos peixes, cai na corrente sanguínea e reduz drasticamente os níveis glicêmicos do sangue dos peixes. Em pouco tempo eles não tem mais energia para nadar, e desorientados, são facilmente capturados pela rede lançada pelo caramujo.

O uso de insulina como toxina é inusitado, em primeiro lugar, porque não existe conhecimento de alguma peçonha que use insulina no processo de envenenamento. Embora existam raros casos de toxinas que subvertem o metabolismo da presa, mas através de uma ação completamente diferente. Existem relatos que in vitro, uma toxina da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus, denominada crotamina, induz a secreção de insulina (ver Toyama MH et al., Biochim Biophys Acta. 2000; 1474(1): 56-60).  O monstro Gila (Heloderma suspectum) secreta em sua saliva Exendin-4, que ativa o receptor de glucagon, estimulando a secreção da insulina da presa e causando, como resposta fisiologica, a queda dos níveis de glicose na presa. Exendin-4 é a base para o desenvolvimento do medicamento Exanitide®, utilizado no tratamento do diabetes melittus. Entretanto, ao secretar insulina, C. geographus subverte o

 

metabolismo de suas presas de forma mecanisticamente direta. Elegantemente os autores citam a possibilidade “do crime perfeito”, relembrando o famoso caso von Bülow, em que o marido de Martha Crawford foi acusado de tentar assassiná-la após injetar uma dose elevada de insulina, que induziu um choque hipoglicêmico; Martha Crawford morreu em 2008 após 28 anos em estado vegetativo, periodo em que Claus von Bülow mesmo que posteriormente inocentado, não pode utilizar a fortuna de sua esposa.

Entretanto, o fato de C. geographus secretar insulina na peçonha é surpreendente, pois, em principio, Helena Safavi e colaboradores não estavam procurando especificamente por ela. Os pesquisadores estavam fazendo um estudo de triagem por meio de sequenciamento de nova geração (‘Next-Gen sequencing’ - NGS), procurando identificar o tipo de mensageiros expressos ao longo de quatro regiões anatomicamente especializadas do duto da glândula de peçonha. O sequenciamento por NGS é uma ferramenta poderosa capaz de obter em larga escala grande número de sequencias de transcritos e identificar assim inclusive sequencias muito raras.

Surpreende que os transcritos insulina-simile são na verdade muito abundantes, sendo o tipo mais expresso entre os genes que não estão relacionados às conotoxinas. Um fator complicador é que os moluscos também produzem uma insulina endógena, mas diferentemente dos vertebrados, a insulina do molusco é produzida pelo sistema neuroendócrino com funções diversas das insulinas de vertebrados. Entretanto, as insulinas de moluscos têm cadeias com massa molecular maior que as dos vertebrados, e apresentam uma ponte de dissulfeto a mais. As insulinas de vertebrados apresentam três pontes, enquanto as de moluscos conservam esse mesmo arranjo de cisteinas e apresentam uma ponte extra distintiva.

Os transcritos altamente expressos detectados neste sequenciamento se dividem em dois tipos: Con-Ins-G1 e Con-Ins-G2, sendo que a cadeia A da Insulina-G1 apresenta 90% de similaridade com insulinas de peixe. Já a cadeia B de G1 tem uma similaridade um pouco menor com as insulinas de vertebrados, variando de 68% a 72%. O arranjo das cisteinas das cadeias A e B da Insulina-G1 possibilita a formação de apenas três pontes dissulfeto, o que é um suporte claro que mimetiza uma insulina de peixe, sendo que sua provável finalidade na peçonha é causar o choque hipoglicêmico na presa. Um suporte adicional de que Con-Ins-G1 é utilizada para atordoar os peixes que serão capturados por C. geographus é que especies de Conus piscívoros que não estendem rede, e apenas arpoam diretamente as presas que se aproximam, não apresentam transcritos de insulina-símile de vertebrado em suas glândulas de peçonha.

Con-Ins-G2 tem similaridade em tamanho e arranjo de padrão de cisteínas com insulinas de invertebrados e poderia ser uma insulina de molusco endógena, mas o local de expressão, o número de transcritos, indica provável papel como toxina. Em C. Geographus, esta provavelmente atua como toxina de defesa contra outros moluscos predadores. Já estudos de RT-PCR em Conus moluscívoros também dectaram sequências similares a Con-Ins-G2, indicando que atuem como toxinas ativas na predação.

Um terceiro transcrito Cons-Ins-G3 também foi dectado, ainda que expresso em menor grau e em uma região diferente da glândula de peçonha, mas que também é similar às insulinas de vertebrados.  O mesmo também está ausente nos caramujos que só arpoam ou se alimentam de moluscos e ou de vermes poliquetos. Utilizando a mesma técnica de RT-PCR associada à clonagem e NGS nas espécies que se alimentam de poliquetos ou de moluscos, os transcritos identificados são similares à insulina de invertebrados e não se detectam insulinas similares às dos vertebrados.

Sequências similares às insulinas G1, G2 e G3 também foram detectadas em C. tulipa, que tem estratégia de predação similar a C. geographus. Neste caso, a insulina mimetiza a do vertebrado atordoando o peixe antes de engolfá-lo com a probóscide. Estes dados indicam que a expressão de sequências insulina-simíle na glândula de veneno de cada espécie se correlaciona com o tipo de presa utilizada.

O estudo de NGS da glândula de veneno de C. geographus foi realizado em associação com análise por espectrometria de massas de alta resolução e sequenciamento MS/MS, o que possibilitou identificar que essas toxinas insulina-símiles são produzidas em grande quantidade nas frações da peçonha de C. geographus. Tanto as cadeias A e B dessas insulinas foram identificadas, como os respectivos hetero-dímeros concatenados pelas corretas pontes de dissulfeto nas frações. Estes resultados mostraram mais isoformas dessas toxinas insulina-símile que as estipuladas pelas sequências dos seus cDNAs precursores e demonstraram também que sofrem diversas modificações pós-tradução, tais como aminoacidos g-glutâmico e hidroxiprolina. Esta é uma caracteristica muito bem conhecida das conotoxinas já estudadas, e é mais um elemento que destingue essas toxinas insulina-símile expressas na glandula de peçonha em relação àquelas endógenas dos moluscos.

Para completar este estudo, estes análogos de toxinas insulina-símile de vertebrados foram testados nos peixes. Aqui o trabalho também é inovador, apresentando um novo método de síntese química de insulina, que consiste em substituir as cisteínas da cadeia A que formam a ponte dissulfeto intracadeia por selenocisteina favorecendo a formação da ponte disseleneto na cadeia A. análogos com pontes disseleneto já haviam sido utilizados pelo grupo do Prof. Baldomero Olivera na sintese de conotoxinas que mantiveram as mesmas propriedades biológicas. Entretanto, é a primeira vez que esta estratégia é utilizada para sintetizar insulina.

Grupos de peixes (o popular ‘paulistinha’ - zebrafish) tiveram suas células betas destruídas, não sendo mais capazes de produzir insulina. Esses animais apresentam elevadas taxas de açúcar no sangue. Ao se injetar 65 ng do petideo sintético Con-Ins-G1, os níveis de açúcar cairam drasticamente de forma análoga ao se injetar insulina humana. O mesmo peptídeo, ao ser liberado na àgua do tanque, foi capaz de reduzir a atividade locomotora dos peixes na dose de 25 nmol/mL. Estes resultados são um indicativo claro de que C. geographus e C. tulipa utilizam toxinas que mimetizam a insulina dos vertebrados para induzir um choque hipoglicêmico durante a captura de suas presas.

Caracteristicamente, a Con-Ins-G1 é uma versão minimizada da insulina dos vertebrados com apenas 43 aminoácidos, enquanto que, por exemplo, a insulina humana tem 51 aminoácidos e as de peixes 50.  A análise desta sequência e sua comparação com a insulina dos vertebrados vai permitir identificar qual a região efetora da ação da molécula de insulina humana e, por exclusão, quais as regiões desempenham prováveis funções regulatórias ou seletivas. Quando os bioquímicos achavam que já sabiam tudo o que havia para se conhecer na molécula de insulina, a peçonha dos Conus nos apresentam novas surpresas e desafios e possivelmente esta nova toxina possibilite o desenvolvimento de melhores medicamentos. Bem como, nos mostra uma elegante estratégia de envenenamento a partir de uma categoria de moléculas nunca antes prevista.



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